前言本標準由中華人民共和國農業(yè)部科技教育司提出。本標準起草單位：中國農業(yè)科學(xué)院植物保護研究所、中國農業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)所、
前?言
本標準由中華人民共和國農業(yè)部科技教育司提出。
本標準起草單位：中國農業(yè)科學(xué)院植物保護研究所、中國農業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)所、農業(yè)部科技發(fā)展中心、中國農業(yè)大學(xué)。
本標準主要起草人：彭于發(fā)、王錫鋒、李寧、張大兵、羅云波、黃昆侖、汪其懷、賈士榮。
本標準為首次發(fā)布。
轉基因植物及其產(chǎn)品檢測?通用要求
1范圍
本標準規定了轉基因植物及其產(chǎn)品檢測的通用要求及轉基因植物PCR檢測實(shí)驗室的操作規范。
本標準適用于轉基因植物及其產(chǎn)品中轉基因成分的檢測。
2規范性引用文件
下列文件中的條款通過(guò)本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注明日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內容）或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據本標準達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本適合于本標準。
GB/T15481-2000?檢測和檢驗實(shí)驗室能力的通用要求
GB/T6682?分析實(shí)驗用水規格和試驗方法
NY/T673?轉基因植物及其產(chǎn)品檢測?抽樣
NY/T674?轉基因植物及其產(chǎn)品檢測?DNA提取和純化
NY/T675?轉基因植物及其產(chǎn)品檢測?大豆PCR方法
3術(shù)語(yǔ)和定義
下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標準。
3.1?一般術(shù)語(yǔ)?General?terms
3.1.1?轉基因生物?genetically?modified?organism?(GMO)
通過(guò)基因工程技術(shù)改變基因組構成的生物。包括轉基因植物、動(dòng)物和微生物。
3.1.2?轉基因植物?genetically?modified?plant?organism?(GMP),?transgenic?plant?
通過(guò)基因工程技術(shù)改變基因組構成的植物，是轉基因生物的一類(lèi)。
3.1.3?定性檢測極限?detection?limit
以轉基因生物（如種子）提取的DNA或標準雙鏈DNA分子作為PCR反應的模板，所能檢測到的脫氧核糖核酸（DNA）的極限（需要確保陽(yáng)性樣品的純度，才能達到本標準檢測方法的靈敏度）。
3.2?與DNA提取和純化相關(guān)的術(shù)語(yǔ)?Terms?relative?to?extraction?and?purification?of?DNA
3.2.1?DNA提取?DNA?extraction
將DNA從一個(gè)樣品的多種組分中分離出來(lái)。
3.2.2?DNA純化?DNA?purification
獲得不含PCR反應抑制因子的DNA。
3.3?與DNA擴增和PCR技術(shù)相關(guān)的術(shù)語(yǔ)?Terms?relative?to?DNA?amplification?and?to?the?PCR?technique
3.3.1?DNA擴增?DNA?amplification
體外放大DNA分子拷貝數的生物學(xué)方法，如PCR。?
3.3.2?擴增子?amplicon
由PCR等DNA擴增方法產(chǎn)生的DNA片段。
3.3.3?聚合酶鏈式反應（PCR）polymerase?chain?reaction，?
模板DNA經(jīng)高溫變性為單鏈，在DNA聚合酶和適宜溫度下，兩條引物分別與模板DNA兩條鏈上的一段互補序列發(fā)生退火，并在DNA聚合酶的催化下以四種dNTP?（deoxyribonucleoside?triphosphate，脫氧核苷三磷酸）為底物，使退火引物延伸從而合成DNA，如此變性、退火和合成DNA反復循環(huán)，使位于兩段已知序列之間的DNA片段呈幾何倍數擴增。
3.3.4?引物?primer
一定長(cháng)度和順序的寡核苷酸鏈。
3.3.5?篩查檢測法?detection?by?screening
用多種轉基因植物共有的標記基因、表達調控序列等通用元件對被檢產(chǎn)品中是否含有轉基因成分進(jìn)行PCR檢測的方法。
3.3.6?身份檢測法?detection?by?identification
與標準品比較確定GMO身份的檢測方法。
3.3.7?靶序列(目的DNA)?target?sequence?(target?DNA)
PCR反應中檢測特異性擴增的DNA序列。
3.3.8?旁鄰片段?(邊界序列)?border?fragment?(border?region,?border?sequence)
插入在染色體上的外源基因序列和宿主生物基因組片段連接的DNA片段。
3.3.9?終點(diǎn)法分析?endpoint?analysis
一種定性、定量的分析方法，如ELISA-PCR，可對PCR反應的擴增子進(jìn)行定性和定量分析。
3.3.10?實(shí)時(shí)分析?real-time?analysis
一種貫串PCR反應過(guò)程，對PCR擴增效率、擴增情況及數據進(jìn)行監控的定量PCR分析方法，如熒光探針的雜交過(guò)程的監控。
3.3.11?連接片段?junction?fragment
兩個(gè)不同功能基因序列之間的連接序列或片段。
3.4?與對照相關(guān)的術(shù)語(yǔ)?Terms?relative?to?controls
3.4.1?GMO陽(yáng)性對照?GMO?positive?control
用于PCR擴增的標準目的DNA或轉基因植物源材料的DNA分子。
3.4.2?GMO陰性對照?GMO?negative?control
用于PCR擴增的標準非轉基因植物材料的DNA分子。
3.4.3?PCR內部對照?PCR?internal?control
加入一種無(wú)關(guān)的DNA序列到純化DNA的樣品中，然后再進(jìn)行PCR擴增，以檢測是否存在PCR反應的抑制物質(zhì)。
3.4.4?陽(yáng)性PCR對照?positive?PCR?control
用含有目的序列的樣品DNA進(jìn)行PCR擴增。
3.4.5?陰性PCR對照?negative?PCR?control
用不含有目的序列的樣品DNA進(jìn)行擴增。
3.4.6?PCR空白對照?PCR?blank,?negative?reagent?control
以水或不含目的DNA試劑進(jìn)行PCR反應，以驗證PCR反應過(guò)程中不被污染。
3.4.7?陰性假定對照?negative?premise?control
在樣品檢測整個(gè)操作過(guò)程中，敞開(kāi)PCR反應體系，以證明檢測的操作環(huán)境中不含有目的基因片段的污染。
3.4.8?陰性提取對照?negative?extraction?control
以水作為材料提取DNA，以證明DNA的抽提和制備過(guò)程中是否發(fā)生污染。
3.5?與探針相關(guān)的術(shù)語(yǔ)?Terms?relative?to?probes
3.5.1?探針?probe
在引物之間的與目的片段特異性雜交的15—30bp寡核鼓苷酸鏈.
3.5.2?內部探針?internal?probe
標記的內部探針。
3.5.3?內標準基因（內源參照基因）?endogenous?reference?gene
具有植物物種專(zhuān)一性且拷貝數恒定、不顯示等位基因變化的保守DNA序列?？捎糜趯蚪M中某一目的基因進(jìn)行定量分析和驗證PCR反應體系中是否存在抑制物質(zhì)。
4原則
轉基因生物及其產(chǎn)品的定性和定量PCR檢測通常包括四個(gè)步驟：
――抽樣
在一批物品中抽取具有代表性的材料，用于檢測分析。
――樣品DNA提取和純化
樣品DNA提取和純化一般包括樣品組織破碎、DNA釋放和DNA從其他化合物中純化等幾個(gè)步驟。
――DNA擴增
對目的序列進(jìn)行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。
――結果分析
對PCR產(chǎn)物進(jìn)行定性或定量分析，確定試驗樣品是否含有轉基因成分或確定轉基因成分的含量。
5?實(shí)驗室通用要求
5.1?一般要求
轉基因植物及其產(chǎn)品檢測實(shí)驗室一般要求按GB/T15481執行。
5.2?特殊要求
轉基因植物及其產(chǎn)品檢測實(shí)驗室分為三個(gè)區：
5.2.1?前PCR區
前PCR區專(zhuān)門(mén)用于準備各種PCR反應體系，此區域必須保持清潔干凈，而且沒(méi)有來(lái)自分子克隆和樣品準備的污染源，前PCR區的試劑、設備和正壓活塞式移液器必須是專(zhuān)用的。
5.2.2?樣品準備區
樣品準備區專(zhuān)門(mén)用于樣品的制備，在制備和操作用于核酸提取的試劑時(shí)應采取以下預防措施：
a)?PCR產(chǎn)物和帶有要擴增的序列的DNA克隆不在該區域進(jìn)行；
b)?檢測的樣品都帶入樣品準備間處理，根據需要提取DNA；
c)?DNA樣品用專(zhuān)門(mén)防護或正壓活塞式移液器操作，防止在吸取樣品時(shí)有氣溶膠遺留；
d)?大體積樣品用單獨包裝的無(wú)菌一次性移液管吸取。
任何時(shí)候都穿實(shí)驗服和戴手套，手套要經(jīng)常更換，尤其在提取DNA過(guò)程中每一步之間都要更換。實(shí)驗服要專(zhuān)門(mén)用于樣品準備間，經(jīng)常清洗。
5.2.3?PCR區
PCR區專(zhuān)門(mén)用于PCR反應和反應后樣品的處理，該區使用的所有試劑、一次性器材和儀器都是專(zhuān)用的。由于PCR實(shí)驗室所遇到的主要污染源是前一次PCR過(guò)程的產(chǎn)物，因此前PCR區和PCR區之間試劑和人員不能混雜，實(shí)驗室的交通方向是單向的，永遠從“凈區”到“臟區”。
6?試劑
6.1?通用要求
6.1.1?用水應符合GB6682中一級水的規格。
6.1.2?所有化學(xué)試劑如果沒(méi)有特別說(shuō)明，應沒(méi)有DNA和核酸酶的污染，應不含PCR抑制劑。
6.1.3?所有試劑應按照shuomingshu要求進(jìn)行保存。
6.2?DNA提取和純化試劑
按NY/T674執行。
6.3?DNA擴增試劑
按NY/T675執行。
7?儀器和設備
通用設備按GB/T15481-2000執行
所有儀器設備應避免植物DNA和核酸酶的污染。
所有儀器設備，尤其取樣器等與試驗樣品接觸的器具，應清潔、不對樣品造成污染。
盛裝樣品的容器或包裝袋應為一次性使用的，以避免交叉污染。
8?操作程序
8.1?通用要求
應設可以檢測或分析下列情況的對照：
――假陽(yáng)性；
――假陰性；
――存在干擾分析的物質(zhì)；
――分析物質(zhì)降解；
――降低檢測方法的靈敏度；
――降低分析物質(zhì)回收率。
8.2?抽樣
按照NY/T673的方法抽樣。
抽取的樣品應具有代表性。
取樣過(guò)程中應避免樣品散落，防止轉基因植物及其產(chǎn)品擴散。
8.3?實(shí)驗室樣品和試驗樣品的準備與儲存
樣品的制備方法視樣品的狀態(tài)和特性而定。固態(tài)樣品的制備宜先粉碎至滿(mǎn)足DNA提取的技術(shù)要求，或用液氮研磨至DNA充分釋放并滿(mǎn)足DNA抽提的技術(shù)要求。液態(tài)樣品的制備宜用緩沖液或水充分洗滌，直至其中的DNA完全溶于緩沖液或水中為止。
在接收時(shí)應注明并記錄樣品重量、生產(chǎn)和包裝條件。
樣品在測試前后應放置在密閉的容器內，防止交互污染。
樣品應在保持組分不發(fā)生變化的條件下儲存。
易腐爛的樣品在分析前應根據需要在4℃、-20℃或-80℃儲存，如有特殊需要應在無(wú)氧條件下儲存。
應記載儲藏條件和時(shí)間。
存查樣品應妥善保存3個(gè)月。檢測為GMO的樣品應妥善保存6個(gè)月，以備復驗。保存期滿(mǎn)后，需經(jīng)無(wú)害化處理。
8.4?DNA提取和純化
DNA提取和純化按照NY/T674的方法。
8.5?定性PCR檢測
定性PCR檢測按照我國或國際認可的方法。
定性PCR檢測對象包括轉基因的目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標記基因等外源基因和元件。檢測時(shí)應設陽(yáng)性對照、陰性對照、試劑空白對照和提取空白對照，同時(shí)應檢測內源基因。
8.6?以蛋白質(zhì)為基礎的檢測
以蛋白質(zhì)為基礎的檢測按照我國或國際認可的方法。
9?通用質(zhì)量保證措施
檢測物品的處置按GB/T15481執行。
檢測結果質(zhì)量的保證按GB/T15481-2000中的5.9執行。
10?結果分析與表述
10.1?通用要求
檢測結果不宜表述為分析樣品不含轉基因生物。
10.2?結果分析
10.2.1?通用要求
以下情況認為樣品含有轉基因植物DNA：
――擴增片段的特異性通過(guò)酶切圖譜、測序、Southern雜交、PCR-ELISA、點(diǎn)雜交或實(shí)時(shí)PCR反應進(jìn)行了驗證。用上述方法該特異性未發(fā)生改變，片段大小也一致，而且與陽(yáng)性對照相同，不含GMO的非GMO對照不存在任何相似大小的擴增片段。
――所有對照和標準品都顯示正常結果。
2個(gè)平行樣品的檢測結果應一致。出現不一致的，應重做2個(gè)平行樣品，最終結果以多數結果為準。
10.2.2?定性PCR檢測結果的表述
10.2.2.1?在模板DNA的量超過(guò)被測物種基因組（內標準基因）DNA量20000倍的情況下，按下列方式表述結果：
――對于陰性結果：“該樣品未檢出×××基因”；
――對于陽(yáng)性結果：“該樣品檢出×××基因”。
10.2.2.2?在模板DNA的量低于被測物種基因組（內標準基因）DNA量20000倍的情況下，按下列方式表述結果：
――對于陰性結果：“該樣品中DNA含量不足，建議對樣品做定量分析以確定所用檢測方法的靈敏度”；
――對于陽(yáng)性結果：“該樣品檢出×××基因”。
11?檢驗報告
檢驗報告應包括下列內容：
――鑒定樣品所需的所有信息；
――引用的標準和方法，并說(shuō)明是定性還是定量方法及靈敏度；
――應用哪種定量方法（終點(diǎn)法或實(shí)時(shí)PCR）；
――接收樣品和分析樣品的大??；
――樣品的接收日期；
――樣品的分析日期；
――測試樣品的大??；
――檢測結果；
――測試中觀(guān)察到的任何特殊情況；
――對結果可能產(chǎn)生影響的任何其他異常情況。
